酶联免疫吸附测定（ELISA，Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种利用抗原-抗体特异性结合来进行免疫反应的定性和定量检测方法。这一检测技术通过将可溶性的抗原或抗体结合到固相载体上，旨在检测血清、尿液和细胞上清液等生物液体中的特定抗原，以实现针对特定指标的定性判断。

ELISA的基本原理是将已知的抗原或抗体吸附到固相载体的表面，并在该表面进行酶标记的抗原-抗体反应。在进行实验时，首先设置标准孔、空白孔和样本孔。标准孔中加入100μL倍比稀释的标准品，空白孔中加入100μL标准品与样本稀释液，其余孔中添加待测样本（建议在检测过程中为所有待检样本和标准品设立复孔，并通过预实验或咨询技术支持来确定合适的稀释倍数）。

将酶标板覆盖膜后，在37℃下孵育90分钟。注意在加样时将样品直接加入酶标板底部，尽量避免触碰孔壁，并轻轻晃动以混匀，避免气泡的产生。建议加样时间控制在10分钟以内。甩净孔内液体后，无需洗涤。接着，每个孔中加入100μL生物素化抗体工作液，再次覆盖膜，37℃温育1小时。随后，甩净孔内液体并用吸水纸拍干。每孔加入350μL洗涤液，浸泡1分钟后甩去或吸干液体，重复清洗步骤3次。

完成洗板后，立即进行下一步操作，避免微孔板干燥。每孔中加入100μL HRP酶结合物工作液，再次覆盖膜，37℃温育30分钟。甩净孔内液体并洗涤5次，步骤同前。然后，每孔加入90μL底物溶液（TMB），覆盖膜，37℃避光孵育约15分钟。根据显色情况，可以适当缩短或延长孵育时间，但不应超过30分钟。一旦标准孔显现出明显的蓝色梯度，便可终止反应。

提前15分钟开启酶标仪预热。在每孔中加入50μL终止液以终止反应，建议在加入终止液时，顺序应与底物溶液的添加顺序一致。最后，利用酶标仪在450nm波长下测定各孔的光密度（OD值）。由于实验操作的不同，标准曲线的OD值可能有所差异。以下是本实验室建立的标准曲线供参考：NE浓度（ng/L）与OD值的关系。

在处理样本时，血清、血浆及其他液体样本通常为100μL检测一个指标。未经分离处理的全血样本（约1ml）可分离出100-200μL血清，需根据客户实际发送的样本情况而定，全血样本应在4℃保存送检，其余液体样本需在-20℃冷冻保存送检。对于组织样本，要求至少为0.1g（约黄豆大小），最终可匀浆分离出约500μL的上清液，支持检测5个指标，并应在-20℃冷冻保存后送检。

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