IPS诱导肠类器官培养分为三个主要阶段：人多能干细胞的培养、内胚层分化及中/后肠模式化诱导以及类器官培养。本文将重点讨论第二阶段——内胚层分化及中/后肠模式化诱导。

一、前期准备

1. 试剂与设备

• 细胞来源：H1/H9hESC或患者来源的iPSCs。
• 培养基：人多能干细胞培养基（abs9403）、RPMI1640（abs9484）。
• 消化液：人多能干细胞消化液（abs9409）。
• 培养基添加剂：L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶液（2mM，abs9295）、双抗（abs9244）。
• 生长因子：ActivinA（100ng/mL，abs05801）、FGF4（500ng/mL，abs06269）、WNT3a（500ng/mL，abs05632）。
• 基质胶：即时用型基质胶（培养板包被，abs9410）、类器官专用基质胶（abs9495）。
• 血清：透析胎牛血清（abs945）。
• 关键设备：表面培养皿、立体显微镜、无菌手术刀、预冷微量离心管。

2. 试剂配制

内胚层分化培养基的配制如下：

• 第1天：RPMI1640 + L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶液（2mM） + 双抗（1%） + ActivinA（100ng/mL）。
• 第2天：第1天配方 + 透析胎牛血清（0.2%）。
• 第3天：第1天配方 + 透析胎牛血清（2%）。

中/后肠分化培养基配制：

• RPMI1640 + 透析胎牛血清（2%） + FGF4（500ng/mL） + WNT3a（500ng/mL）。

二、hPSCs传代与铺板

1. 细胞传代（耗时约2小时）

使用人多能干细胞消化液处理hPSCs直至边缘卷起。用细胞刮刀轻轻剥离细胞团，反复吹打至1-2mm大小细胞团。按照1:6的比例接种至Matrigel包被的24孔板（每孔约5000个细胞团），轻敲培养板使细胞均匀分布，置于37°C培养过夜。

2. 细胞扩增至85-90%融合（3-4天）

每天更换人多能干细胞培养基，并观察细胞密度。关键在于密度过高（自发分化）或过低（分化效率低）时需重新铺板。

三、内胚层分化（3天）

1. 第1天：吸除人多能干细胞培养基，加入Day1内胚层培养基（无血清），培养24小时。
2. 第2天：更换为Day2内胚层培养基（含0.2%透析胎牛血清），培养24小时。
3. 第3天：更换为Day3内胚层培养基（含2%透析胎牛血清），培养24小时。

可选的分化效率验证：通过免疫染色检测FOXA2/SOX17双阳性细胞，效率应达到85-90%。

四、中/后肠模式化（3-4天）

1. 诱导球状体形成

吸除内胚层培养基，加入中/后肠分化培养基并每日更换。48小时后，使用立体显微镜观察上皮增厚，72-96小时后球状体（spheroids）会脱离单层细胞。

2. 收集球状体

使用200μL枪头收集游离的球状体，每管约50个，置于冰上备用。

本期推荐的试剂包括：尊龙凯时人多能干细胞培养基（500ml）、人多能干细胞消化液（100mL）、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶液（100×，200mM，100mL）、即时用型基质胶（100mL）、RPMI1640（500mL）、双抗（100mL）以及相关试剂与耗材。

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