尊龙凯时的研究表明，自然杀伤细胞（NK细胞）在肿瘤治疗中提供了比T细胞更为安全可靠的选择。针对CD19靶点的嵌合抗原受体（CAR）-NK细胞已成功在淋巴B细胞肿瘤患者中证明其安全性和有效性。然而，CAR-NK细胞的生产过程复杂且成本高昂，因此本研究采用了一种名为“别针”（Pin）的非基因改造技术，以便于抗肿瘤NK细胞的生产。

这种新方法利用脐血来源的单个核细胞（PBMCs），结合细胞因子IL-2和IL-15，以及经过爱波斯坦-巴尔病毒（EBV）转染的B淋巴母细胞滋养层细胞，来生成NK细胞。随后，使用改良的抗CD20和抗CD19抗体（这些抗体对CD16a的亲和力显著提高）进行孵育和扩增，最终得到的NK细胞表面携带抗CD19/CD20抗体，借助抗体依赖性细胞毒性（ADCC）来增强对CD19或CD20阳性肿瘤细胞的杀伤效应，达到与CAR-NK细胞相似的治疗效果。

在别针抗体的生产与纯化过程中，对人类IgG1的Fc的CH2结构域进行了四个氨基酸的修改：S239D、H268F、S324T和I332E。所有别针抗体均由位于法国贝桑松的RD-Biotech公司生产，采用CHO细胞合成并通过蛋白A进行纯化。具体的抗原结合域序列来自于临床使用的单抗，包括别针-CD20单抗（利妥昔单抗的序列）、别针-HER2单抗（曲妥珠单抗的序列）、别针-EGFR单抗（西妥昔单抗的序列）以及别针-CD19单抗（布纳吐莫单抗的序列）。

细胞实验所用的K562、Daudi、Toledo、Raji等细胞系通过ATCC或ECACC采购，所有悬浮细胞在含10% FBS的RPMI-1640 GlutaMAX培养基中培养，而HCT116、MDA-MB-468和MCF7细胞则在含10% FBS的DMEM高糖培养基中生长。淋巴瘤细胞患者的样本来自蒙彼利埃大学医院的CRB-CHUM平台。抗体定量检测中，利用BD藻红蛋白PE荧光定量试剂盒结合流式细胞仪，测定CD19和CD20的绝对值。

NK细胞的体外扩增（eNK细胞生产）过程中，采用EasySep人类CD3阳性分选试剂盒II，从脐血单个核细胞中去除CD3阳性细胞，将剩余细胞在含10% FBS的RPMI-1640或5%人类血清的培养基中培养，并添加100 IU/mL的IL-2和5 ng/mL的IL-15。培养物需要定期更换，并保证NK细胞密度维持在≥0.6 × 10^6个细胞/mL，培养周期为14至20天。EBV转染B淋巴母细胞于Day 5至Day 7时适量添加，这些细胞经过70 Gy的辐照处理。最终，扩增后的eNK细胞会在流式细胞术中检测表面标志物的表达情况。

eNK细胞在使用Muse细胞分析仪计数后，将以2 × 10^6个细胞/mL的密度重悬于含有10μg/mL别针-CD20/CD19/EGFR/HER2单抗的培养基中，进行1小时的孵育。在细胞毒性检测中，eNK或别针单抗eNK与CFSE标记的靶细胞青睐在96孔板上共培养24小时，流式细胞术可用以评估靶细胞的杀伤程度。同时测定培养基上清液中的分泌因子。

在体内细胞毒性实验中，10周龄的雌性NSG小鼠将分别腹腔注射eNK、别针CD20-eNK和别针CD19-eNK，注射荧光标记的Nalm6细胞与Raji细胞或Daudi细胞。4小时后对小鼠进行处死，收集腹水细胞并进行流式细胞分析，以评估eNK细胞的活性及体内细胞毒性能力。其他针对小鼠体内白血病模型的实验中，注射Raji细胞后对小鼠进行eNK或别针-CD20eNK的治疗，并检测各组织中肿瘤细胞的占比。

在体外实验中，别针-CD20eNK显示出通过别针单抗依赖机制的细胞毒性，与普通eNK相比，该细胞对Daudi和Toledo细胞展示了更强的杀伤效果。同时，别针-CD20eNK在培养中展现了更高的细胞存活率和细胞毒性持续能力。针对B淋巴细胞的体内清除实验显示，别针-CD20eNK能够有效消除CD20阳性B细胞，而对其他免疫细胞并无显著影响。

鉴于CD19在肿瘤细胞中的广泛表达，研究表明使用尊龙凯时的别针CD20-eNK和别针CD19-eNK对原发性B细胞淋巴瘤患者的肿瘤细胞均表现出较高的杀伤能力，尤其是在可能发生抗药性的情况下，CD19可作为潜在的新的治疗靶点。在双重别针武装策略下，通过结合CD20和CD19抗体的eNK细胞，可以更有效地针对B细胞肿瘤，提高其治疗潜力。总体来看，结合尊龙凯时的优化方法促进了对NK细胞的非基因修饰，使其对抗肿瘤细胞的能力得到了显著增强。