在1992年，Manfred Gossen与Hermann Bujard的合作开启了基因表达研究的新篇章，开发出了Tet-off系统。相关成果以“Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters”发表在PNAS期刊。Tet-on/Tet-off系统是分子生物学和基因工程中最经典且应用广泛的可诱导基因表达系统之一。其基础源自于大肠杆菌转座子Tn10的四环素抗性操纵子（TetO），主要由Tet响应元件（TRE，由7个TetO序列组成）、Tet阻遏蛋白（TetR）及其改造蛋白组成，可在真核细胞（如哺乳动物细胞）中精确、可逆地控制目标基因的表达。

基本原理

TetR蛋白能特异性地与TetO结合。当细胞内没有四环素（Tet）时，TetR与TetO结合，阻止下游抗性基因的表达；而一旦Tet出现，TetR的构象改变，使其从TetO上分离，从而解除对抗性基因的抑制，导致抗性蛋白的表达，进而使细菌获得耐药性。

01 Tet-off系统原理

tTA是由TetR与单纯疱疹病毒VP16蛋白的转录激活结构域融合而成的蛋白，充当四环素抵抗转录激活因子。当细胞内不存在多西环素（Dox）时，tTA与TRE结合，启动下游基因表达；而在Dox存在时，tTA的构象变化导致其从TRE脱落，进而关闭下游基因的表达。

02 Tet-on系统原理

反义tTA（rtTA）由反义TetR（rTetR）与单纯疱疹病毒VP16蛋白的转录激活结构域融合而成，功能与tTA相反。rtTA只有在四环素存在时，才能激活TRE。当Dox未存在时，rtTA无法结合TRE，导致下游基因表达关闭；而在Dox出现时，rtTA构象改变并结合TRE，从而开启下游基因的表达。

关键特性与优势

01 高度严谨：在未诱导状态下（Tet-off有Dox；Tet-on无Dox）背景泄露通常非常低，而在诱导状态下（Tet-off无Dox；Tet-on有Dox），表达水平可接近强组成型启动子。
02 可逆性：通过添加或撤除Dox，可以迅速反复地开启或关闭基因表达，这对于研究基因功能的动态变化至关重要。
03 剂量依赖性：基因表达水平可以通过Dox浓度进行精细调控，浓度越高，Tet-on诱导越强，Tet-off抑制越强。
04 快速响应：Dox作为小分子，能够快速穿过细胞膜。添加Dox后，基因表达将在几小时至一两天内发生显著变化；撤除Dox后，表达也会相应下降。
05 低细胞毒性：在常用浓度范围内，Dox对大多数细胞类型的毒性较低，适用于长期实验与体内研究。
06 广泛适用性：该系统已成功应用于小鼠、大鼠等多种模式生物。

应用场景

1 功能基因研究
1）在特定时间、细胞类型或组织中诱导某个基因的表达，以研究其过表达对细胞表型、信号通路、发育或疾病进程的影响。
2）在转基因动物（如小鼠）中实现时空特异性的基因表达，利用组织特异性启动子驱动rtTA/tTA表达，通过Dox给药控制在特定组织和具体时间开启或关闭目标基因。

2 神经科学研究
可结合光遗传学、钙成像等技术，研究神经系统的功能与机制。例如，利用Tet-off系统与光敏蛋白结合，标记小鼠大脑中与恐惧记忆相关的记忆痕迹细胞，进而激活这些细胞，探讨记忆的编码、存储及提取机制。

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